La 25-hydroxyvitamine D (25-OH-D) circulante est largement reconnue comme le meilleur indicateur du statut en vitamine D. Dans la circulation sanguine, les deux principaux métabolites de la vitamine D sont la 25-OH vitamine D3 et la 25-OH vitamine D2. la 25-OH-D3 est principalement dérivée de la vitamine D3 produite par la lumière solaire dans la peau, tandis que la 25-OH-D2 est dérivée des plantes dans l'alimentation. Il existe actuellement deux grands types de méthodes utilisées en routine pour mesurer la 25-OH-D : les méthodes basées sur une séparation chromatographique suivie d'une détection directe non immunologique et les immunodosages compétitifs. La plupart des immunodosages dépendent d'un anticorps qui peut détecter à la fois la 25-OH vitamine D2 et la 25-OH vitamine D3 et donne des résultats totaux. Mais la proportion de détection de la 25-OHD2 est variable.
Deux méthodes non immunologiques de détection directe sont actuellement disponibles : la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et la chromatographie liquide avec spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/ MS). Les méthodes chromatographiques sont capables de mesurer indépendamment la 25-OH-D2 et la 25-OH-D3 avec une précision et une sensibilité excellentes.
D'autre part, de nombreuses études et articles scientifiques montrent l'inexactitude de la mesure de la vitamine D totale avec les immunodosages commerciaux sans séparer et mesurer les métabolites de la vitamine D2 et de la vitamine D3 individuellement. Il est recommandé que tout dosage de 25-OH-D dans les laboratoires cliniques mesure de manière égale la 25-OH-D2 et la 25-OH-D3 afin de rapporter une valeur de 25-OH-D totale. Les immunodosages évalués mesurent la 25-OH-D totale (à la fois la 25-OH-D3 et la 25-OH-D2), mais la réaction croisée avec la 25-OH-D2 et la 25-OH-D3 varie de 52 à 100 % selon les méthodes.
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