Le Fer Fe (II) de toutes les formes d’hémoglobine, à l’exception de la sulfhémoglobine, est oxydé en fer Fe(III) de la méthémoglobine qui, à son tour, réagit avec le cyanure ionisé (CN-) pour Former la cyanmethémoglobine, un dérivé stable qui absorbe à 540 nm. L’intensité de la coloration produite est proportionnelle à la concentration de l’hémoglobine totale de l’échantillon.