La bilirubine directe (conjuguée) réagit avec le sel de diazonium 2,4-dichlorophényldiazonium (2,4-DPD) en présence d’acide sulfamique en formant azobilirubine. Ce complexe coloré peut être quantifiée par spectrophotométrie à 546 nm. Des deux fractions de bilirubine présentes dans le sérum, glucuronate de bilirubine (conjuguée) et bilirubine libre associée à l’albumine (non conjuguée), seule la première réagit directement, tandis que la bilirubine libre doit être dissociée de la protéine par un accélérateur pour réagir. La bilirubine indirecte est calculée par la différence entre la bilirubine totale (avec accélérateur) et la directe (sans accélérateur). Les concepts « directe » et « indirecte » se rapportent exclusivement aux caractéristiques de la réaction en présence ou en l’absence d’accélérateurs ou de solubilisants, et équivalent seulement d’une manière approximative aux fractions de bilirubine citées.