La méthode est basée sur l’hydrolyse de α-Naphtyl phosphate au pH 5,0 par la phosphatase acide (ACP) produisant le α-naphtol et le phosphate inorganique. Le pentanodiol agit comme accepteur du phosphate et augmente ainsi la sensibilité de la réaction.
Le α-naphtol réagit avec un sel diazoïque, le Fast Red TR*, formant un complexe coloré dont la concentration est directement proportionnelle à l’activité de la ACP présente dans l’échantillon.